Existují téměř všechny společnosti, které prodalyprášek enzymu bromelainje smíchán s papainem. Je obtížné vyčistit bromelain na 5000GDU/g. ale je velmi snadné vyčistit papain na 1000,000 GDU/g. dokonce až 2 000 000 GDU/g. ale funkce bromelainu se od papainu liší. barva, zápach, rozpustnost ve vodě a chuť kontrastují s falešným produktem a pravým produktem. Liší se tím, že správný prášek enzymu bromelain je šedý, bez zápachu, chuti a nerozpustný ve vodě.
Ale falešný bromelain má následující vlastnosti:
● Je světle žlutý, aromatický a jemně sladký a rozpustný ve vodě. Je to charakteristika papainu.
● Používá se ke snížení zánětu a zmírnění bolesti. ale v papainu téměř žádné tyto funkce nejsou.
● Používá se pouze jako doplněk stravy, nikoli jako přísada do potravin, ale skutečně může být farmaceutické kvality. Papain se však používá pouze jako prášek na zjemnění masa a kosmetika.
Bromelain jsme testovali pomocí gelu SDS-PAGE a metod GELATIN DIGESTION UNIT ANALYTICAL a HPLC, v gelové metodě SDS-PAGE je méně cílových molekul pro falešný produkt.
Níže jsou uvedeny výsledky elektroforézy SDS Page
Skvrna ve výše uvedeném ukazuje, že pouze správný produkt má stejnou skvrnu na správném místě na obrázku, ale falešný produkt má na sobě malé skvrny, což znamená, že molekulová hmotnost je sotva viditelná.
Molekulová hmotnost bromelainu je asi 33 000, ale molekulová hmotnost papainu je 21 000. A HPLC chromatogram:
Uvidíte, že pouze správný extrakt obsahuje správné molekulové hmotnosti bromelainu a je detekovatelný pomocí HPLC.
Pokud jsme však testovali pouze analytickou metodou jednotky rozkladu želatiny (GDU), viz příloha II. Správný i nepravdivý produkt mají stejné výsledky jako níže:
Stonek ananasu je velmi levný a poměr od stonku k bromelainu je velmi nízký, ve výrobním procesu dochází k určitému znečištění.
Téměř všechny továrny na prášek bromelainového enzymu jsou blízko pole. Používají čerstvou nať. Je nemožné poslat stonek na velkou vzdálenost. Se surovinou by se mělo manipulovat co nejdříve po sběru z pole nebo by měla být skladována v prostředí s nízkou teplotou (4-8 stupeň), aby se zabránilo degradaci bílkovin. V reálném životě výrobce vlastně nemůže splnit žádnou ze dvou výše uvedených podmínek kvůli příliš velkému množství stonků ananasů. Rozumnou metodou je rovnováha mezi dobou manipulace a ztrátou proteinové aktivity. Obvykle se surové suroviny vyrábějí v sezóně sklizně ananasu a surové suroviny se skladují v prostředí s nízkou teplotou (4-8 stupeň).
Provádíme nějaké testy elektroforézy SDS Page, teoreticky ji můžeme zvýšit na 10,{1}} nebo 20,000. ale bude to velmi drahé. 5000 GDU/g a učinit jej stabilním možná na maltovém nosiči / mikroenkapsulovaném nebo tak něčem plus extrakce/čištění organické kvality.
Příloha I
● Metoda 5 SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS-PAGE)
SDS-PAGE je metoda elektroforézy na denaturovaném polyakrylamidovém gelu. Princip separace proteinů u této metody je založen na skutečnosti, že většina proteinů se může v hmotnostním poměru sloučit s aniontovou povrchově aktivní látkou dodecylsulfát sodný (SDS) za vzniku komplexu
Negativní náboj nesený proteinovými molekulami daleko převyšuje čistý náboj přirozených proteinových molekul, eliminuje nábojový efekt různých proteinových molekul a odděluje proteiny podle jejich molekulární velikosti.
Tato metoda se používá pro kvalitativní identifikaci, kontrolu čistoty a nečistot a kvantitativní stanovení proteinů.
1 Přístrojové zařízení
Napájecí zdroj s konstantním napětím nebo konstantním proudem, svislá desková elektroforetická nádrž a forma na výrobu lepidla.
2. Činidla
(1) Voda.
(2) Separační gelový pufr (4x, roztok A) 1,5mol/L trihydroxymethylaminomethanový pufr s kyselinou chlorovodíkovou. Naváží se 18,15 g trihydroxymethylaminomethanu a rozpustí se v přiměřeném množství vody. Upravte hodnotu pH na 88 kyselinou chlorovodíkovou a zřeďte na 100 ml vodou.
(3) Navažte 58.0g akrylamidu a 20 g N,N'-methylenbisakrylamidu ve 30procentním roztoku akrylamidu (roztok B), rozpusťte v teplé vodě a zřeďte na 200 ml, přefiltrujte filtračním papírem (uchovávejte v temný).
(4) Odvažte 10 g dodecylsulfátu sodného v 10% roztoku SDS (roztok C), rozpusťte ve vodě a zřeďte na 100 ml
(5) Komercializační činidlo roztoku tetramethylethylendiaminu (TEMED, D roztok).
10% roztok persíranu amonného (roztok E) Odváží se 10 g persíranu amonného, rozpustí se ve vodě a zředí se na 100 ml. Před použitím se doporučuje připravit nebo skladovat odděleně při -20 stupních po dobu 2 týdnů.
(7) Koncentrovaný kaučukový pufr (4x, F roztok) 0,5mol/L Trihydroxymethylaminomethan Pufr s kyselinou chlorovodíkovou, navažte 6,05 g trihydroxymethylaminomethanu, přidejte vhodné množství vody k rozpuštění, upravte hodnotu pH na 6,8 pomocí chlorovodíkové kyseliny a zředí se vodou na 100 ml.
(8) Elektrodový pufr (10 x) Odvažte 30 g trimethylaminomethanu, 144 g glycinu a 10 g dodecylsulfátu sodného, rozpusťte je ve vodě a zřeďte na asi 800 ml. Upravte hodnotu pH na 8.{7}},8 pomocí kyseliny chlorovodíkové a zřeďte na 1000 ml vodou.
(9) Neredukovaný vzorkový pufr (4 x) Odvažte 303g trimethylaminomethanu, 20mg bromfenolové modři a 8,0g dodecylsulfátu sodného, odměřte 40ml glycerolu, rozpusťte ve vodě a zřeďte na asi 80ml. Upravte pH na 68 kyselinou chlorovodíkovou a zřeďte na 100 ml vodou.
(8) Elektrodový pufr (10 x) Naváží se 30 g trimethylaminomethanu, 144 g glycinu a 10 g dodecylsulfátu sodného, rozpustí se ve vodě a zředí se na asi 800 ml. Upravte hodnotu DH na 81-88 pomocí kyseliny chlorovodíkové a zřeďte na 1000 ml vodou
(9) Neredukovaný vzorkový pufr (4 x) Odvažte 3,03 g trimethylaminomethanu, 20 mg bromfenolové modři a 80 g dodecylsulfátu sodného, odměřte 40 ml glycerolu, rozpusťte ve vodě a zřeďte na přibližně 80 ml. Upravte pH na 6,8 pomocí kyseliny chlorovodíkové a zřeďte na 100 ml vodou.
(10) Redukovaný pufr testované látky (4×) Odvažte 3,03 g trimethylaminomethanu, 20 mg bromfenolové modři a 80 g dodecylsulfátu sodného, odměřte 40 ml glycerolu, rozpusťte a zřeďte vodou na přibližně 80 ml a přidejte - 20ml merkaptoethanolu, upravte pH na 6,8 kyselinou chlorovodíkovou, zřeďte vodou na 100 ml (nebo 3,03 g trimethylaminomethanu, 20 mg bromfenolové modři, 8,0 g dodecylsulfátu sodného, odměřte 40 ml glycerolu, rozpusťte ve vodě a zřeďte do 80 ml, upravit pH na 6,8 kyselinou chlorovodíkovou, zředit vodou na 100 ml a před použitím přidat dithiothreitol na 100 mmol/l).
● Příloha II
Analytická metoda jednotky na trávení želatiny (GDU)
A. Účel: Tento postup se používá ke stanovení proteolytické aktivity Bromelain Enzyme Powder.
B. Vybavení:
1. pH metr
2. Vodní lázeň s konstantní teplotou 45.0 stupňů ± 0,1 stupně
3. Analytická bilance
4. Odměrné baňky
5. Odměrné pipety
6. Časovač
7. Digitální byreta (přesnost 0,1 ml)
8. Digestoř
9. Automatické pipety
C. Bezpečnostní opatření:
Tento test je nutné provést v digestoři.
1. Používejte standardní laboratorní bezpečnostní postupy.
2. Formaldehyd: Připravte a uchovávejte po celou dobu v digestoři. Známý karcinogen a teratogen.
3. Peroxid: Silné okysličovadlo
D. Činidla a přípravky činidel:
1. Destilovaná voda: přibližně 50}0 ml: pH se upraví na 4,5 pomocí 0,1N HC1.
2. Želatinový substrát:
A. 25 gramů želatiny (Mikrobiologie. 1.04070) se rozpustí ve 375 ml horké vody a přivede se k varu. Ochlaďte na 45 stupňů.
b. pH se upraví na 4,5 pomocí 0,1N HC1 a zředí se na 500 ml destilované vody o pH 4,5.
C. Udržujte želatinový substrát při teplotě 45 stupňů.
3. Vyrovnávací roztok:
A. Přidejte 15 g NaCl pomalu do 40-50 ml vody v kádince o objemu 150 ml a míchejte do rozpuštění.
b. Přidejte 0,570 ml kyseliny octové.
C. Upravte pH na 4,5 pomocí 0.2N HCL (objem bude větší než 100 ml.)
4. 3 procenta peroxidu vodíku:
A. Pipetujte 2,5 ml 30% peroxidu vodíku (zásobní roztok) do 25ml odměrné baňky a zřeďte na objem destilovanou vodou o pH 4,5
5. 37% formaldehyd pH 9.0: a. Upravte dostatečný objem (100 ml) formaldehydu na pH 9,0 pomocí 0,1N NaOH (přibližně 20 ml formaldehydu na vzorek před úpravou pH.)
Analytická metoda jednotky digesce želatiny (GDU) - pokračování.
6. 0.100 N NaOH: (zakoupeno standardizované) a. Zásobní roztok: standardizovaný na 0,100 N
E. Postup:
1. Příprava enzymu:
A. Výpočet přípravy enzymu
Hmotnost {{0}}/cílová aktivita (přibližně 0,05 g nebo 50 mg)
A. Enzym se přesně naváží do 50 ml odměrné baňky
B. Přidejte 8,3 ml tlumivého roztoku.
b. Nechte stát 30 minut při pokojové teplotě.
C. Zřeďte na 50 ml destilovanou vodou s pH 4,5, přidejte malou míchací tyčinku a míchejte dalších 10 až 15 minut.
2. Enzymový postup:
A. Do každé ze dvou 100ml kádinek obsahujících míchací tyčinky napipetujte 25 ml želatinového substrátu a umístěte je na 5 minut do vodní lázně o teplotě 45 stupňů, jednu pro testovací roztok a druhou pro slepý roztok.
b. Testovací roztok:
1) Přidejte 10 ml roztoku bromelainového prášku do kádinky určené pro testovací roztok, začněte měřit a krouživými pohyby.
2) Po přesně 20 minutách inkubace při 45 stupních přidejte 0,1 ml 3% peroxidu vodíku a protřepejte.
3) Inkubujte dalších 5 minut.
4) Kádinku vyjměte z vodní lázně a za stálého míchání vložte pH sondu.
5) Zaznamenejte pH po 10 sekundách (počáteční pH)
6) Upravte pH na 6.0 pomocí 0,1N NaOH. (Přibližně 2-4 ml)
*Poznámka: Při úpravě pH na 6.{1}} buďte opatrní při pH 5,8; pH se zvyšuje pomalu a nepatrné přídavky NaOH v tomto bodě významně zvýší pH.
7) Za stálého míchání přidejte 10 ml 37% formaldehydu pH 9,0.
8) Zaznamenejte pH po 10 sekundách a 1 minutě.
9) Titrujte na pH 9.0 pomocí 0,1N NaOH.
10) Zaznamenejte titrační objem.
Toto je testovací titr, T.c.
Slepý roztok: Slepý roztok by měl být spuštěn současně s testovacím roztokem. Toho se dosáhne zahájením stanovení slepého roztoku 12 minut po spuštění testovacího roztoku. To vám dává čas na dokončení testu na testovacím roztoku, než budete muset pokračovat s prázdným roztokem. 1) Přidejte 0,1 ml 3% peroxidu vodíku do kádinky určené pro slepý roztok a promíchejte.
2) Po přesně 20 minutách inkubace při 45 stupních přidejte 1,0 ml roztoku bromelainu a protřepejte.
3) Inkubujte dalších 5 minut.
ANALYTICKÁ METODA JEDNOTKOVÉHO DIGESTACE ŽELATINY (GDU) - pokr.
4) Kádinku vyjměte z vodní lázně a za stálého míchání vložte pH sondu.
5) Zaznamenejte pH po 10 sekundách (počáteční pH)
6) Upravte pH na 6.0 pomocí 0,1N NaOH. (Přibližně 2-4 ml)*Viz poznámka výše.
7) Za stálého míchání přidejte 10 ml 37% formaldehydu pH 9,0.
8) Zaznamenejte pH po 10 sekundách a 1 minutě.
9) Titrujte na pH 9.0 pomocí 0,1N NaOH.
10) Zaznamenejte titrační objem. Toto je slepý titr, B.
F. Výpočet:
1. Definice: Jedna jednotka štěpení želatiny je takové množství enzymu, které po 20 minutách štěpení při 45 stupních uvolní 1 mg aminodusíku ze standardního roztoku želatiny při pH 4,5 nebo pH 5,5 (GDU pH 4,5 nebo pH 5,5).
GDU/g {{0}} (TB) x 14 x N x 50 Hmot. (g) Kde: T=Testovací titr (ml 0,1 N NaOH) B=Slepý titr (ml 0,1 N NaOH) N=Normálnost standardizovaného NaOH (tj. 0,100) Hmot. (g)=Počáteční hmotnost enzymu
G. Testovací parametry:
1. Enzymové přípravky se ředí na koncentraci přibližně 0,001 g/ml (1 mg/ml) nebo pro koncentrát bromelainového enzymu přibližně 1-2 GDU/ml. Referenční materiál je testován při každém běhu, aby byla zajištěna přesnost metody.
Guanjie poskytuje volně ložený bromelainový prášek pomocí testovací metody GDU. Náš výrobní proces funguje v rámci standardních dílen CGMP, využívá tři výrobní linky ve dvou továrnách a dvě nezávislé laboratoře. V případě jakýchkoli dotazů týkajících se našich produktů nás prosím kontaktujte nainfo@gybiotech.com.
